Endo-fri Plasmid Midiprep Kit

Sættet bruger en glasfibermembran med specifik adsorption til plasmid og en speciel bufferkombination, som effektivt kan udvinde forskellige endotoksinfrie plasmider (endotoksinindhold Mindre end eller lig med 0.1 EU/ug) fra dyrkede bakterier. Ifølge det forskellige kopiantal af plasmid er udbyttet af plasmid generelt 100 ~ 400 ug. Det ekstraherede højrenhedsplasmid kan bruges i mange biologiske eksperimenter, såsom restriktionsenzymfordøjelse, ligeringsreaktion, PCR-amplifikation, sekventering, transformation, transfektion osv.

RNase Sendes med våd is og opbevares ved -20 grad. Andre reagenser sendes og opbevares ved stuetemperatur; gyldig i 12 måneder.

1. Vandfri ethanol er påkrævet, men medfølger ikke i dette sæt.

2. Forbered 42 graders vandbad eller varmemodul.

3. Tilføj al den RNase A, der er med i sættet, til Buffer P1 før brug, og den kan opbevares ved 4 grader i 6 måneder.

4. Tilsæt venligst 64 mL vandfri ethanol til buffer PW før brug.

5. Hvis BufferP2 udfælder, opvarm den i et vandbad ved 37 grader i et par minutter for at genoprette klaring. Efter brug af Buffer P2 skal låget lukkes med det samme for at undgå langvarig kontakt med luft.

6. Forafkøl BufferP3 ved 4 grader før brug.

1. Kolonnebalance: Tilsæt 2 mL buffer BL til HiBind DNA Midi Columns, centrifuger ved 4.500×g i 2 minutter ved stuetemperatur, kassér filtratet, og sæt HiBind DNA Midi Column tilbage i opsamlingsrøret (den behandlede kolonne er bedst bruges med det samme).

2. Høst bakteriekultur fra 20~50 ml frisk bakterievæske ved centrifugering ved 8,000×g i 1 minut ved stuetemperatur. Saml kulturen i 50 mL centrifugerøret (fjern supernatanten så meget som muligt). Plasmider med lav kopi eller mere end 10 kb foreslår, at mængden af ​​bakterier bør øges passende, og doseringen af ​​Buffer P1, Buffer P2 og Buffer P3 bør øges i lige store forhold.

3. Tilsæt 2,5 ml BufferP1 (kontroller venligst, om du vil tilføje RNase A først), brug en pipette eller vortex oscillator til at suspendere bakterierne grundigt (sørg for at sprede bakterierne grundigt, ellers vil det påvirke lysisen, hvilket resulterer i lav kvalitet og renhed af det ekstraherede plasmid).

4. Tilsæt 2,5 mL BufferP2, vend den forsigtigt og vend på hovedet i 8~10 gange for at gøre bakterierne fuldstændigt lyserede (dette trin bør ikke rystes voldsomt og bør udføres inden for 5 min). På dette tidspunkt bør opløsningen blive klar og klistret, hvis den ikke bliver klar, kan det være, at der er for mange bakterier og lyseringen ikke er fuldstændig, og det bør overvejes at reducere mængden af ​​bakterier.

5. Tilsæt 2,5 mL BufferP3 (forafkøl ved 4 grader i forvejen), øjeblikkeligt og forsigtigt på hovedet 10~12 gange, opløsningen fremstår kompakt agglomereret, centrifuger ved 8,000×g i 15 minutter ved stuetemperatur, langsomt hæld supernatanten i kolonnefilteret, skub håndtaget for at filtrere, og filtratet opsamles i Nuclease-Free 15 mL centrifugerør (selvforsynet).

6. Tilsæt 750 μL Buffer ER, læg 10 min på isen efter blanding på hovedet (bland på hovedet 3~5 gange i løbet af perioden), opløsningen er gennemsigtig blå.

7. Inkuber 5 minutter ved 42 grader, opløsningen genvinder turbiditet. centrifuger ved 4.500×g i 5 minutter ved stuetemperatur, opløsningen opdeles i øvre og nedre lag, det øverste lag er klar vandfase og det nederste lag er blåt. Saml forsigtigt den øvre vandfase i det nye Nuclease-fri 15 mL centrifugerør (selvforsynet).

8. Tilsæt vandfri ethanol 0.5 gange volumenet af ovenstående opløsning, bland på hovedet og overfør til HiBind DNA Midi Column (ikke mere end 4 ml hver gang).

9. Centrifuger ved 4.500 x g i 3 minutter ved stuetemperatur, kassér filtratet. Sæt HiBind DNA Midi-søjlen tilbage i opsamlingsrøret (opløsningen i trin 8 kan føres gennem kolonnen mange gange).

10. Tilføj 3,5 mL buffer ED til HiBind DNAMidiColumn, centrifuger ved 4.500×g i 3 minutter ved stuetemperatur, kassér filtratet. Sæt HiBind DNA Midi-søjlen tilbage i opsamlingsrøret.

11. Tilføj 3,5 mL buffer PW (bekræft, om der skal tilsættes vandfri ethanol) til HiBind DNAMidiColumn, centrifuger ved 4.500×g i 3 minutter ved stuetemperatur, kassér filtratet. Sæt HiBind Midi DNA-søjlen tilbage i opsamlingsrøret.

12. Gentag trin 11.

13. Centrifuger ved 4.500 × g i 10 minutter ved stuetemperatur, anbring HiBind DNA Midi-søjlen i et nyt nukleasefrit 15 mL centrifugerør. Åbn låget og anbring 10 minutter ved stuetemperatur for at fordampe ethanolen grundigt.

14. Tilføj 500~1000μL Buffer TE eller Endo-Free Water til midten af ​​membranen og anbring den ved stuetemperatur i 5 min. Centrifuger ved 4.500×g i 5 min. Hvis du har brug for at øge effektiviteten af ​​plasmidgenvinding, kan den opnåede opløsning føjes til HiBind DNA-søjlen igen, placeres ved stuetemperatur i 5 minutter og centrifugeres ved 4.500 × g i 5 minutter.

15. Det opnåede plasmid-DNA kan bevares i lang tid ved -20 grad.

1. Læs venligst produktmanualen omhyggeligt før brug.

2. Undgå direkte kontakt med buffer P2 og P3. Luk låget umiddelbart efter brug af Buffer ED.

3. Når kopiantallet af det ekstraherede plasmid er lavt, eller plasmidfragmentet er større end 10 kb, bør mængden af ​​bakterieopsamling øges, og doseringen af ​​Buffer P1, Buffer P2 og Buffer P3 bør øges i lige store forhold.

4. Buffer TE kan forvarmes til 60~65 grader, og elueringsinkubationstiden kan forlænges for at forbedre elueringseffektiviteten.

5. Ethanol skal fordampes fuldstændigt før eluering af plasmidet for at undgå påvirkning af resterende ethanol på nedstrøms eksperimenter.

6. For din sikkerhed og sundhed skal du bære en laboratoriefrakke og engangshandsker.

Kun til forskningsbrug!

Populære tags: endo-frit plasmid midiprep kit, Kina endo-frit plasmid midiprep kit producenter, leverandører, fabrik