Beskrivelse

Tekniske parametre

Produktintroduktion

Produktnavn	Kat. Ingen.	Spec.
2×SYBR Grøn qPCR Master Mix (Ingen ROX)	G3320-01	1 ml
	G3320-05	5×1 ml
	G3320-15	15×1 ml

Produktbeskrivelse/Introduktion

2×SYBR Green qPCR Master Mix (Ingen ROX) er en speciel 2× premix til qPCR-reaktion ved brug af SYBR Green I kimærisk fluorescensmetode, som indeholder alle qPCR-komponenter undtagen primere og DNA-skabeloner, som kan reducere operationstrinnene, forkorte tiden for tilføje prøver og reducere risikoen for kontaminering. Kernekomponenten er gensplejset hot-start Taq DNA Polymerase, som effektivt lukker DNA-polymeraseaktivitet og forhindrer uspecifik amplifikation ved lave temperaturer ved effektivt at

kombinerer monoklonalt antistof og Taq DNA Polymerase, med mange fordele såsom høj specificitet og høj sensitivitet, og er koblet med en reaktionsbuffer optimeret til qPCR. Det er meget velegnet til høj specificitet og høj sensitivitet qPCR reaktion. Dette produkt er et 2x forblandet reagens indeholdende den optimale koncentration af SYBR Green I til qPCR-reaktion, som kan opnå en god standardkurve i et bredt kvantificeringsområde, nøjagtig kvantificering af målgener, god reproducerbarhed og høj tillid.

Opbevarings- og forsendelsesbetingelser

Skib med våd is. Opbevares ved -20 grader uden lys, gyldig i 12 måneder. Undgå fryse-tø-cyklusser. Efter optøning kan den opbevares stabilt ved 4 grader i en måned uden lys.

Produktindhold

Komponent	G3320-01	G3320-05	G3320-15
2×SYBR Grøn qPCR Master Mix (Ingen ROX)	1 ml	5×1 ml	15×1 ml
Manuel	Ét eksemplar

Analyseprotokol/procedurer

Inden start

1. Real-Time PCR-amplifikationsapparat;

2. Specielt reaktionsrør eller reaktionsplade til forsøg;

3. PCR-primere (referenceprimerdesignprincipper);

4. Mikropipette og autoklaveringsspidser;

Procedurer

1. Anbefal qPCR-reaktionssystemet:

Komponent	20 μL rxn	50 μL rxn	Endelig koncentration
2×SYBR Grøn qPCR Master Mix (Ingen ROX)	10 μL	25 μL	1×
Fremadprimer (10 μM)a	0.4 μL	1 μL	0.2 μM
Reverse Primer (10 μM)a	0.4 μL	1 μL	0.2 μM
Skabelonb	Variabel	Variabel	efter behov
Nuklease-frit vand	Tilføj til 20 μL	Tilføj til 50 μL

en. Normalt kan en god amplifikationseffekt opnås med slutkoncentrationen på {{0}},2 μM. Når reaktionsydelsen er dårlig, kan primerkoncentrationen justeres i området 0.2-1.0 μM.

b. Mængden af template-tilsætning varierer afhængigt af antallet af kopier af målgenet, og den passende mængde template-tilsætning studeres ved gradientfortynding. Den bedste tilsætningsmængde af template-DNA i 20 μL reaktionssystemet var mindre end 100 ng. Når cDNA'et (RT-reaktionsopløsning) fra RT-PCR-reaktionen blev brugt som skabelon, bør tilsætningsmængden ikke overstige 10% af det endelige qPCR-volumen.

2. PCR-reaktionsprogram (kan justeres passende i henhold til instrumentet)

A. To-trins proces *					B. Tre-trins proces*
Scene	Trin	Cykler	Temperatur	Tid	Scene	Trin	Cykler	Temperatur	Tid
Etape 1	Prædegeneration	1	95 grader	30 sek	Etape 1	Prædegeneration	1	95 grader	30 sek
Etape 2	Degeneration	40	95 grader	15 sek	Etape 2	Degeneration	40	95 grader	15 sek
	Udglødning-forlængelse		60 grader	30 sek		Udglødning		55-65 grad	10 sek
	Udglødning-forlængelse		60 grader	30 sek		Forlængelse		72 grader	30 sek
Etape 3	Smeltekurve	1	Instrument standardindstillinger		Etape 3	Smeltekurve	1	Instrument standardindstillinger

*: Hvis amplifikationsspecificiteten skal forbedres, kan to-trins procedure eller annealingstemperatur anvendes; For at forbedre amplifikationseffektiviteten kan en tre-trins procedure eller forlængelsestid anvendes.

a: For fluorescenssignalopsamling skal du indstille den eksperimentelle procedure i henhold til instrumentets instruktionsmanual.

Note

1. Blandes forsigtigt på hovedet før brug. Undgå at hvirvle og ryste for at undgå bobler. Reagenser blandes godt før brug.

2. Reagenser skal placeres på is, når reaktionsopløsningen tilberedes.

3. Produktet indeholder fluorescerende farvestof SYBR Green, så stærkt lys bør undgås ved tilberedning af PCR reaktionsopløsning.

4. Brug venligst nye engangsspidser til klargøring og emballering af reaktionsopløsningen for at undgå kontaminering mellem prøverne.

5. Undgå gentagen fryse-optøning af Master Mix og prøv at bruge den inden for en måned efter optøning.

Kompatible instrumenter

Mærke af PCR-maskine	G3320 (Ingen ROX)	G3321 (Lav ROX)	G3322 (Høj ROX)
ABI termoliv	PikoRealTM Cycler	7500/7500 hurtig, ViiA 7™ QuantStudio™-serien	5700/7000/7300/7700/7900/ 7900HT/7900 HT Fast, StepOne™, StepOne Plus™
Stratagene		Mx3000P®/3005P™/4000™
Bio-Rad	Alle serier
Eppendorf	Realplex 2s, Mastercycler®ep realplex
IIIumina	Eco QPCR
Cepheid	SmartCycler®
Qiagen Corbett	Rotor-Gene®-serien
Roche	LightCycler™-serien
Takara	Thermal Cycler Dice-serien
Analytikjena	qTOWER-serien
qTOWER	LineGene serien

Primer Design Principper

1. Længden af amplifikationsproduktet anbefales at være mellem 80-300 bp;

2. Primerlængde: 18-25 bp;

3. Indholdet af base G+C i primere skal være mellem 40%-60%;

4. Tm-værdiforskellen mellem fremadgående primere og omvendte primere er mindre end 2 grader, og Tm-værdien mellem 58-62 grader er den bedste;

5. Tilfældighed af basisfordeling;

6. Primere må hellere ikke indeholde selvkomplementære sekvenser, ellers vil de danne en sekundær hårnålestruktur;

7. Der bør ikke være mere end 4 komplementære eller homologe baser mellem to primere, ellers vil der dannes primerdimer, især komplementær overlapning ved 3'-enden;

8. Den 3'-terminale base af primeren foreslås at være G eller C;

9. Der blev ikke fundet andre ikke-specifikke produkter i NCBI-sammenligningsresultater.

Fejlfinding

Problemer	Mulige tilfælde	Løsninger
Ved slutningen af reaktionen fremkom ingen amplifikationskurve, eller CT-værdien forekom for sent	Skabelonkoncentrationen er for lav	Reducer antallet af skabelonfortyndinger for at gentage eksperimentet, startende med den højeste koncentration, hvis prøvekoncentrationen er ukendt.
	Nedbrydning af primere	Forbered skabelonen og gentag eksperimentet.
	PCR-hæmmere til stede i reaktionsblandingen.	Generelt skabelonoverførsel, øge skabelonfortyndingen eller genforbered skabelonen med høj renhed for at gentage eksperimentet.
	Mulig nedbrydning af primere	Primere, der ikke har været brugt i lang tid, bør først testes for integritet ved PAGE-elektroforese for at udelukke deres nedbrydning.
	Lav forstærkningseffektivitet	Forøg primerkoncentrationen, prøv et tre-trins amplifikationsprogram, eller redesign primerne.
	Forstærkningsprodukter for lange	Amplifikationsproduktlængden blev kontrolleret til 80-300 bp.
Forstærkningssignal i ikke-skabelonstyring	Forurening af reaktionssystem	· Skift først vandet i blindprøvekontrollen, hvis det samme stadig sker, fortsæt med at udskifte primere, spidser, PCR-rør eller aktivér en ny Master Mix; Reaktionssystemet er forberedt i en ultra-ren bænk for at minimere aerosolkontamination.
Forstærkningssignal i ikke-skabelonstyring	Ikke-specifik amplifikation såsom primerdimere	Generelt er det normalt, at amplifikationsprodukter vises i blindprøven efter 35 cyklusser, som bør analyseres sammen med smeltekurven; redesign primerne, juster primerkoncentrationen eller optimer PCR-reaktionsproceduren.
Smeltekurven har flere toppe	Primer design er suboptimalt	Nye primere blev redesignet efter primerdesignprincipper.
	Primerkoncentrationen er for høj	Reducer primerkoncentrationen passende
	Genomisk kontaminering i cDNA-skabelon	Den ekstraherede RNA-opløsning fordøjes ved hjælp af DNA-enzymer, såsom dsDNase, for at fjerne genomisk kontaminering eller til at designe transintronprimere
Dårlig reproducerbarhed af eksperimenter	Fejlen ved at tilføje stikprøve er stor	Brugen af nøjagtig pipette, med højkvalitets sugehoved nøjagtig pipette; Skabelon med høj fortynding, tilføjelse af skabelon med stort volumen for at reducere prøvetagningsfejl; Reaktionsvolumenet af qPCR blev forstørret
	Skabelonkoncentrationen er for lav	Reducer skabelonfortyndingstiderne for at gentage eksperimentet.
	Temperaturafvigelse på forskellige steder af qPCR-instrumentet	Kalibrer qPCR-instrumentet regelmæssigt
Amplifikationskurven er ikke jævn	Fluorescenssignalet er for svagt, produceret efter systemkorrektion	Sørg for, at farvestofferne, der er forblandet i Master Mix, ikke nedbrydes; Udskift fluorescerende signal for at indsamle bedre qPCR-forbrugsstoffer
Amplifikationskurven knækker eller glider	Skabelonkoncentrationen var højere, og baseline-endepunktsværdien var større end CT-værdien	Baseline-endepunktet (Ct-værdi -3) blev reduceret, og dataene blev genanalyseret
Amplifikationskurver for individuelle brønde faldt pludselig kraftigt	Der er bobler i reaktionsrøret	Sørg for, at MIX er fuldstændig opløst, og lad være med at hvirvle og oscillere jævnt; Efter at prøven er tilsat, fjernes boblerne ved centrifugering med let elastik. Præ-denatureringstiden blev forlænget til 10 minutter for at fjerne boblerne

Kun til forskningsbrug!

Populære tags: 2×sybr grøn qpcr master mix (ingen rox), Kina 2×sybr grøn qpcr master mix (ingen rox) producenter, leverandører, fabrik

2×SYBR Grøn QPCR Master Mix (Ingen ROX)